“两虫”(贾第鞭毛虫、隐孢子虫)检测

        贾第鞭毛虫是感染小肠的双核鞭毛原生动物寄生虫。感染通常会导致慢性虚弱的腹泻，体重减轻和吸收不良。饮用被污染的水可能会导致贾第鞭毛虫病。传播也通过直接接触而发生，尤其是与无症状的携带者接触以及食物污染。高风险类别包括幼儿，免疫功能低下的患者以及以前没有接触过的患者。

        隐孢子虫是脊椎动物的原生动物寄生虫。在世界. 上大多数地区,它与腹泻病有关，是旅行者腹泻的常见原因。该疾病是由厚壁卵囊传播的，该卵囊对普通消毒剂和饮用水的常规氯化反应具有显着抵抗力。人与人之间的传播很普遍。隐孢子虫病是获得性免疫缺陷综合症患者的一一种严重机会性感染。临床表现包括腹泻，腹痛，恶心，呕吐和体重减轻。在健康人中， 感染通常是自限性的。

        在艾滋病和免疫抑制患者中，该病可能会持续时间延长并可能会危及生命。目前“两虫”已被列入国标GB/T 5749- 2006非常规检测项目。国标GB/T 5750-2006中检测方法源于EPA1623。方法流程为水样过滤淘洗、免疫磁分离、荧光染色和镜检。在水样的过滤淘洗步骤中，国标描述了三种方法可选，其中Envirochek过滤淘洗方法为仲裁法。

        北京格维恩科技有限公司作为PALL“两虫”检测产品(Envirochek滤器、 多样品洗脱振荡器及试剂)国内总代理，十几年来与国内疾控、环保、水务、第三方检测、食药监、海关、高校及研究院合作开展“两虫”检测项目，客户数量过百家。同时提供EPA1623.1方法(2012年改进版本、针对含有磁性物质的复杂水样显著提高回收率)供客户选择。

优势

1.         水样过滤易于使用。无需组装或清洁过滤器架或洗脱设备。

2.         可同时处理多份样品，节省时间。

3.         一次性成品，可避免交叉污染和假阳性结果。

4.         一般能够回收70%以_ 上的靶标生物。

5.         滤膜孔径小至1 um,能够保留隐孢子虫和贾地鞭毛虫。

6.        所有EnvirochekHV囊式采样滤器均经过完整性试验。

7.        使用安全。无需处理或拆分可能受到污染的滤芯。

8.        各囊式滤器均分别带有序列号,便于追溯。

9.        Envirochek囊式采样滤器已获美国EPA方法1622和1623.1确认与注册。

10.        Envirochek HV囊式采样滤器专用于1,000 L或更多净化水，经确认可用于50 L源水。

11.        Envirochek HV囊式采样滤器(产 品编号: 12096和12097) 通过了英国DWI成品水监管测试。

12.        Envirochek囊式采样滤器已在ISO/DIS 15553-2006中注册。

        水样淘洗:

PALL专用的洗脱振荡器可以同时洗脱8个样品，15分钟即可完成。设备操作简单,不需要维护、清洗、消毒及额外的辅助设备如气泵等。设备可靠性强，正常使用情况下，三年内仪器出现硬件问题免费换新。

        免疫磁分离IMS:

利用DynalBead带有特异性的“ 两虫”抗体磁珠与样本中目标虫体抗原结合从而高效选择性分离。

        染色镜检

利用BTF生产的Easystain染色试剂盒，内含配制好的FIFC及DAPI染液及配套试剂，无需复染，染色效果、操作简单。镜检配置专用的研究级正置荧光显微镜，同时拥高像素图像采集系统。图像清晰，可保存。荧光模块、物镜等均可拓展。满足客户多种需求。

        “两虫”检测方法及系统介绍

        我公司推荐使用的Envirochek“两虫”检测方法是GB5749-2006国标和GB/T5750-2006《生活饮用水标准监测方法》中测定生活饮用水和水源水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的方法，也是GB/T5750-2006国标规定的两虫检测的仲裁法，同时也是美国EPA制定的测定水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的标准方法EPA1623 (EPA-821-R-99-66)。

        贾第鞭毛虫、隐孢子虫简述

        1. 隐孢子虫的生活史

        隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种寄生性的原生动物，其中感染人的是微小隐孢子虫C. parvum。

        隐孢子虫的卵囊呈圆形，直径约4~6微米，成熟卵囊内含4个呈月牙形的子孢子和呈颗粒物状的残留体。

        隐孢子虫的生活周期包括无性生殖、有性生殖和孢子生殖三个阶段，可在同一宿主体内完成。随宿主粪便排出的卵囊(oocyts)具有感染性，新宿主吞食了存在于水中的卵囊就会感染隐孢子虫病。隐孢子虫整个生活周期约需5~11天。

        2. 贾第鞭毛虫的生活史

        贾第氏鞭毛虫（Giardia）是一种寄生性的原生动物，感染人的是肠贾第鞭毛虫G.intestinalis。

        孢囊呈椭圆形，长约8~18微米，宽约5~15微米，未成熟的孢囊有2个核，成熟的孢囊具4个核。

        其生活史由孢囊和滋养体两个不同的发育阶段组成。

        由于贾第鞭毛虫和隐孢子虫卵囊和孢囊的表面包裹着一层较厚的囊壁，因此具有非常强的环境抗性。常规消毒工艺的氯浓度不能有效灭活隐孢子虫和贾第鞭毛虫，它们通过水厂构筑物进入供水管网，威胁人们健康。传统检测手段有严重的滞后性，不能及时准确的报告水中有关两虫的信息。

        3. 两虫的危害

        隐孢子虫和贾第鞭毛虫产生的卵囊和孢囊对环境有很大的抗性，人体只要摄入几个就会生病。

        贾第鞭毛虫致病剂量为10~100个活孢囊，隐孢子虫致病剂量仅为1~10个活卵囊。

        主要感染方式：主要通过患病动物粪便中的卵囊污染食物和饮用水而感染人畜。

        主要易感人群为：儿童、老人或免疫力低下的人群。

        发病症状：头晕、恶心、腹痛、呕吐、腹泻、低烧甚至死亡等。

        1993年美国Wisconsim州Milwaukee市两虫污染事件导致了约40万人受到感染，其中160多人死亡。

        1998年夏，悉尼自来水公司在管网中检出了高浓度的孢囊和卵囊，要求用户将水煮沸后饮用，持续时间长达35天。

        1997年美国对各水厂原水的月度调查表明：卵囊的高阳性检出率为10.4%，孢囊的高阳性检出率为31.3%。

        德国有83%的水样中检测出有两虫，马来西亚有90%检出，香港有100%检出，甚至在滤后水中也检测出两虫。

        美国国家环保局于1997年7月~1998年12月调查结果显示，4.62%~10.43%的水厂原水中有隐孢子虫，而13.6%~31.25%的水厂原水中有贾第鞭毛虫。在亚洲、非洲及拉丁美洲，每年有2.5~5亿人次受到两虫感染。

        “EPA1623方法”概述

        1. 美国EPA于1996年12月起草，于1999年1月修正并通过测定隐孢子虫的1622(EPA-821-R-99-001)方法，在此基础上能同时测定隐孢子虫和贾第鞭毛虫的1623 (EPA-821-R-99-66)方法于1999年4月被批准进行样本分析。

        2. EPA1623 方法中主要推荐并在实验中采用的是Pall公司的Envirochek滤器。

        3. 为了保障饮用水安全，实施优质供水，国家建设部在2005年6月1日正式实施的《城市供水水质标准》（CJ/T 206-2005）中增加了贾第鞭毛虫和隐孢子虫的微生物指标。要求：

        4. 国家卫生部在2006年12月29日发布的《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）中增加了贾第鞭毛虫和隐孢子虫的微生物指标。要求：在实验方法的淘洗/浓缩部分,首先推荐了Envirochek方法(Pall公司)，供选的还有Filta-Max方法和Filta-MaxXpress快速法。

        5. Envirochek方法(Pall公司)作为国标的方法，同时也是国标规定的仲裁方法。

        6. 为了完成国标的检测要求，开展行之有效的“两虫”检测工作，建立“两虫”检测实验室势在必行。我国一些供水企业和研究部门已经开始了这方面的工作。

        7. 目前国内已经建立“两虫”检测系统的城市有天津、太原、深圳、东营、北京、大庆、南京、昆明、济南、厦门、重庆、中山、广州、青岛、杭州、佛山、南宁、成都、株洲、上海、无锡、长沙等等，其中除广深等早期自建实验室之外，其余90%以上的“两虫”检测系统均是由北京格维恩公司和广州格维恩公司设计实施的。

        “EPA1623方法”内容简述

        一、方法概述

        1. 本方案是通过对过滤、免疫磁分离（IMS）和免疫检验化验（FA）显微镜等方法来确定水中的隐孢子虫(CAS登记号137259-0-8)和贾第鞭毛虫（CAS登记号137259-49-5）的特性与浓度，隐孢子虫和贾第鞭毛虫可以通过4'，6-Diamidino-Phenylindole(DAPI)着色和差分干涉相衬（DIC）显微镜检验法进行确定。本方案经批准可用于地表水，但如果实验室证明符合该方案执行验收标准，也可以用于其它水样。

        2. 本方案符合美国环境保护局调查和探测标准，通过了美国EPA认证。本方案以环境保护局指定的专家团所提供的实验室试验为基础。专家团负责提供一种用于回收与探测原生动物改进草案，能够通过最小的附加研究来检测和实现。

        3. 本方案不用于鉴定隐孢子虫或贾第鞭毛虫种类或其它原寄主种类，也不能确定探测到的卵囊和包囊的活性及其侵染性。

        4. 本方案应由精于通过过滤，免疫磁分离和免疫检验化验对隐孢子虫和贾第鞭毛虫进行探测的人员使用。第22.2部分把这类人定义为分析员。不熟悉通过本方案技术对环境样本进行分析的试验室应获得使用水样过滤技术、免疫磁分离和单克隆抗体荧光抗体着色，利用明场和差分干涉相衬（DIC）显微镜检验法对生物微粒微观检验的技术。

        二、主要实验环节

        1. 通过水样过滤，把卵囊、包囊和外来物质留在过滤器上。

        2. 洗脱与分离

        2.1 过滤器上的物质经过洗脱，洗脱物通过离心分离作用使卵囊和包囊成为球形，同时分离出的上清液被吸取。

        2.2 卵囊和包囊被与抗隐孢子虫和抗贾第鞭毛虫抗体结合的磁珠附加装置磁化。通过使用磁体，磁化后的卵囊和包囊从其它物质中分离，其它物质被清除。接着，磁珠联合体从卵囊和包囊中分离。

        3. 计数

        3.1 卵囊和包囊在穴槽载玻片上被磁荧光标记的单性抗体和4'，6-Diamidino-Phenylindole(DAPI)溶液着色。用荧光和差分干涉相衬（DIC）显微镜检验法对着色样本进行检验。

        3.2 通过仔细观察每一个载玻片，对符合隐孢子虫卵囊和包囊大小，外形和荧光特性的对象进行定性分析。

        3.3 通过计算载玻片上被确定为卵囊和包囊的对象来进行定性分析。

        3.4 通过使用再现校准和过滤，免疫磁分离，着色和显微镜检验系统来保证质量。

（以上流程详见附件“隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测方法讲稿”）

特点

1. 本系统采用《生活饮用水标准检验方法》GB/T 5750.12-2006，

2. 同时也符合美国EPA第1622和1623号方法，

3. 英国DWI（饮用水监察署）第1524号方法，

4. ISO（国际标准化组织）第15553号方法。

5. Envirochek®及Envirochek HV胶囊式取样过滤器

6. 用于从水源水或成品水中浓缩、回收隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊

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9. 简单易用，过滤支架或洗提装置无需装配，也无需清洗。

10.  可同时处理多个样本，从而节约时间。

11. 一次性使用的设计，消除交叉污染导致的假阳性可能。

12. 对于目标有机体的回收率通常高于70%。

13. 利用孔径为1μm的滤膜，100%截留收集隐孢子虫和贾第鞭毛虫，从而消除了假阴性可能。

14. 更高的使用安全性。作为自主式胶囊式过滤器，意味着过滤元件无需处理，也不需分割。

15. 序列编码，以供追踪。

16.  Envirochek HV胶囊式过滤器均已通过百分百完整性测试。

产品介绍

Envirochek胶囊式取样过滤器

有效过滤面积：1,300 cm2

外形尺寸

长度：21.6厘米（8.5英寸）

直径：6.1厘米（2.4英寸）

入口/出口连接

12.7 mm (1/2 in.) 倒刺直软管

洗提能力

下限为127mL